Dieser Praxisratgeber bietet erprobte Strategien für die Optimierung der HPLC und UHPLC in unterschiedlichsten Einsatzgebieten. Im ersten Teil werden Optimierungsstrategien für unterschiedliche Betriebsarten und Analyte behandelt, von Kleinmolekülen bis hin zu chiralen Substanzen und Biomolekülen. Der zweite Teil beschreibt die rechnergestützte Optimierung und stellt die gängigen Software-Tools und deren Leistungsspektrum vor. Weitere Teile beschreiben Optimierungsstrategien aus Sicht von Routineanwendern in großen Industrie- und kleineren Auftragslaboren sowie aus Sicht verschiedener Gerätehersteller.
Dieser Leitfaden ist gleichermaßen für Einsteiger wie für routinierte Anwender geschrieben und lässt keine Frage zum optimalen Einsatz der HPLC unbeantwortet.
Stavros Kromidas wurde nach langjähriger Tätigkeit im Verkauf von Waters Chromatography Inhaber und Geschäftsführer der Novia GmbH, später selbständiger Berater. Der promovierte Chemiker arbeitet seit 1978 auf dem Gebiet der HPLC und hat seit 1984 zahlreiche Trainingskurse und Workshops geleitet. Er ist Autor einer regelmäßigen HPLC-Kolumne in der Zeitschrift 'LaborPraxis' sowie einer Reihe außerordentlich erfolgreicher Bücher.
Vorwort V
Zum Aufbau des Buches VII
Teil I Optimierungsstrategien für einzelne Fragestellungen1
1 2D-HPLC Methodenentwicklung für erfolgreiche Trennungen 3
Dwight R. Stoll
1.1 Motivationen fur zweidimensionale Trennung 3
1.2 Auswahl des zweidimensionalen Trennungsmodus 4
1.3 Wahl der Trennmodi 8
1.4 Auswahl der Trennungsbedingungen 12
1.5 Beispiele fur die Methodenentwicklung 15
1.6 Ausblick 18
2 Do you HILIC? Mit Massenspektrometrie? Dann bitte systematisch23
Thomas Letzel
2.1 Ausgangssituation und optimale Nutzung von stationaren HILIC-Phasen 26
2.2 Ausgangssituation und optimale Nutzung von mobiler HILIC-Phase 28
2.3 Weitere Einstellungen bzw. Bedingungen speziell fur massenspektrometrische Detektion (siehe auch Kap. 3) 35
3 Optimierungsstrategien in der LC-MS-Methodenentwicklung39
Markus M. Martin
3.1 Einfuhrung 39
3.2 Methodenneuentwicklung fur HPLC-MS-Trennungen 39
3.3 Ubertragen von HPLC-Bestandsmethoden an dieMassenspektrometrie 51
3.4 Abkurzungen 55
4 Strategien für die erfolgreiche Charakterisierung von Proteinbiopharmazeutika57
Szabolcs Fekete, Valentina DAtri und Davy Guillarme
4.1 Einfuhrung in Proteinbiopharmazeutika 57
4.2 Von der Standard- zur Hochleistungschromatographie von Proteinbiopharmazeutika 58
4.3 Online-Kopplung von nicht denaturierenden LC-Modi mit MS 62
4.4 Mehrdimensionale LC-Ansatze fur Proteinbiopharmazeutika 63
4.5 Schlussfolgerung und Zukunftstrends in der Analyse von Proteinbiopharmazeutika 66
5 Optimierungsstrategien für die HPLC-Trennung von Biomolekülen73
Lisa Strasser, Florian Füssl und Jonathan Bones
5.1 Einleitung 73
5.2 Optimierung der chromatographischen Trennung 73
5.3 Optimierung der Geschwindigkeit einer HPLC-Trennung 78
5.4 Optimierung der Sensitivitat einer HPLC-Trennung 80
5.5 Multidimensionale Trennungen (siehe auch Kap. 1) 81
5.6 Uberlegungen bezuglich MS-Detektion (siehe auch Kap. 3) 82
5.7 Schlussfolgerungen und Ausblick 84
6 Optimierungsstrategien in der Supercritical Fluid Chromatography (SFC) mit gepackten Säulen87
Caroline West
6.1 Auswahl einer stationaren Phase, die eine angemessene Retention und gewunschte Selektivitat ermoglicht 88
6.2 Optimierung der mobilen Phase zur Elution aller Analyten 93
6.3 Optimierung von Temperatur, Druck und Flussrate 98
6.4 Uberlegungen zur SFC-MS-Kopplung 101
6.5 Zusammenfassung der Methodenoptimierung 102
6.6 SFC als zweite Dimension in der zweidimensionalen Chromatographie 104
6.7 Weiterfuhrende Literatur 104
7 Optimierungsstrategien für chirale Trennungen107
Markus Juza
7.1 Enantioselektive (Chirale) Trennungen 107
7.2 Wie fangt man an? 109
7.3 SFC zuerst? 129
7.4 Gibt es Regeln, wie man die vorhersagen kann, welche CSP fur mein Trennproblem geeignet ist? 129
7.5 Welches sind die am erfolgversprechendsten CSPs? 129
7.6 Kann man CSPS miteinander vergleichen? 131
7.7 ,,No-Gos, Fallstricke und Besonderheiten bei der chiralen HPLC und SFC 134
7.8 Gradienten in der chiralen Chromatographie 135
7.9 Alternative Strategien zur chiralen HPLC und SFC auf Polysaccharid-CSPs 135
7.10 Wie lose ich Trennprobleme fur Enantiomere, ohne ins Labor zu gehen? 138
7.11 Die Zukunft der chiralen Trennung schnelle chirale Trennung (cUHPLC und cSFC)? 139
8 Optimierungsstrategien basierend auf der chemischen Struktur der Analyte145
Christoph A. Fleckenstein
8.1 Einleitung 145
8.2 Der Einfluss funktioneller Gruppen 147
8.3 Wasserstoffbruckenbindungen 149
8.4 Einfluss derWasserloslichkeit durch Hydratbildung bei Aldehyden und Ketonen 151
8.5 Bedeutet polar gleich hydrophil? 152
8.6 Peroxidbildung bei Ethern 154
8.7 Der pH-Wert in der HPLC 156
8.8 Betrachtungen und Loslichkeitsabschatzungen in komplexeren Molekulen 159
8.9 Der Octanol-Wasser-Koeffizient 161
8.10 Hansen-Loslichkeitsparameter 165
8.11 Fazit und Ausblick 167
9 Optimierungsmöglichkeiten im regulierten Umfeld171
Stavros Kromidas
9.1 Einfuhrung 171
9.2 Vorbemerkung 171
9.3 Auflosung 173
9.4 Peak/Rauschen-Verhaltnis 178
9.5 Variationskoeffizient, ;;;; 178
Teil II Computergestützte Strategien (in-silico-Anwendungen)183
10 Strategie zur automatisierten Entwicklung von RP-HPLC-Methoden für die domänenspezifische Charakterisierung monoklonaler Antikörper185
Jennifer La, Mark Condina, Leexin Chong, Craig Kyngdon, Matthias Zimmermann und Sergey Galushko
10.1 Zielsetzung 185
10.2 Einfuhrung 185
10.3 Automatisierte Methodenentwicklung und Software-Tools 187
10.4 Wechselwirkung mit Instrumenten 188
10.5 Saulen 189
10.6 Probenvorbereitung und HPLC-Analyse 190
10.7 Automatisierte Methodenentwicklung 191
10.8 Saulen-Screening 193
10.9 Schnelle Optimierung 193
10.10 Feinoptimierung und Proben-Profiling 195
10.11 Robustheitstests 196
10.12 Verbesserung der Methode 203
10.13 Schlussfolgerungen 203
11 Fusion QbD® Software: ICH-konformes Lebenszyklus-Managementfür analytische Methoden: Entwicklung, Validierung, Transfer207
Richard Verseput und Ingo Green
11.1 Einfuhrung 207
11.2 Ubersicht experimentelles Design und Datenmodellierung in Fusion QbD 209
11.3 Zielprofil einer analytischen Methode 210
11.4 APLM-Stadium 1 Entwurf und Entwicklung des Verfahrens 211
11.5 APLM-Stadium-2 Verifizierung der Methodenleistung 224
11.6 Was folgt? Erwartungen fur 2020 und daruber hinaus 226
Teil III Anwender berichten229
12 Moderne HPLC-Methodenentwicklung231
Stefan Lamotte
12.1 Robuste Ansatze fur die Praxis 233
12.2 Ausblick 241
13 Optimierungsstrategien in der HPLC aus Sicht eines Industriedienstleisters243
Juri Leonhardt und Michael Haustein
13.1 Einleitung 243
13.2 Forschung und Entwicklung 244
13.3 Qualitatskontrolle 244
13.4 Prozessbegleitende Analytik 245
13.5 Entscheidungsbaum zur Optimierungsstrategie in Abhangigkeit vom spateren Einsatzgebiet 248
14 Optimierungsstrategien in der HPLC aus Sicht eines Dienstleisters der UNTIE®-Prozess der CUP-Laboratorien249
Dirk Freitag-Stechl undMelanie Janich
14.1 Ubliche Herausforderungen fur einen Dienstleister 249
14.2 Ein typisches, langwieriges Projekt wie es meistens lauft und wie man es nicht machen sollte! 250
14.3 Wie machen wir es besser? Der UNTIER-Prozess der CUP-Laboratorien 251
15 Optimierungsstrategien in der HPLC259
Bernhard Burn
15.1 Definition der Aufgabestellung 260
15.2 Relevante Daten fur die HPLC-Analyse einer Substanz 262
15.3 GenerischeMethoden 282
15.4 Generelle Tipps zum Optimieren von HPLC-Methoden 288
15.5 Saulendimension und Partikelgrosen 306
Teil IV Hersteller berichten309
16 Optimierungsstrategien für Ihre HPLC Agilent Technologies311
Jens Trafkowski
16.1 Erhohung der Trennleistung: Zero Dead Volume Fittings 312
16.2 Trennleistung: Minimierung der Dispersion 312
16.3 Erhohung des Durchsatzes verschiedeneWege zur Senkung der Analysenlaufzeit 313
16.4 Minimale Verschleppung fur die Spurenanalytik: Multiwash 315
16.5 Steigern Sie die Leistung Ihrer vorhandenen Systeme modular oder schrittweise Aufrustung bestehender Systeme 315
16.6 Erhohen Sie Automatisierung, Benutzerfreundlichkeit und Reproduzierbarkeit mit den Merkmalen einer quaternaren High-End-UHPLC-Pumpe 317
16.7 Automatisierung erhohen: Lassen Sie Ihren Autosampler die Arbeit machen 319
16.8 System fur mehrere Anwendungen:Multimethodenund Methodenentwicklungssysteme 320
16.9 Kombinieren Sie Probenvorbereitung mit LC-Analyse: Online SPE 321
16.10 Leistungssteigerung mit einer zweiten chromatographischen Dimension: 2D-LC (siehe auch Kap. 1) 322
16.11 Think different! Verwenden Sie uberkritisches CO2 als Eluent: SFC Supercritical Fluid Chromatography (siehe auch Kap. 6) 323
16.12 Bestimmen Sie verschiedene Konzentrationsbereiche in einem System: hochauflosende Bereichs-HPLC (HDR) 324
16.13 Automatisieren Sie sogar Ihren Methodentransfer von anderen LC-Systemen: Intelligent System Emulation Technology (ISET) 325
16.14 Zusammenfassung und Schlussfolgerung 326
17 Den Anwender starkmachen Optimierung durch Individualisierung329
Kristin Folmert und Kathryn Monks
17.1 Einleitung 329
17.2 Die eigenen Anforderungen definieren 329
17.3 Ein Assistent eroffnet viele neue Moglichkeiten 333
17.4 Die verbauten Materialien im Fokus der Optimierung 338
17.5 Softwareoptimierung erfordert Offenheit 341
17.6 Ausblick 342
18 (U)HPLC-Grundlagen und darüber hinaus345
Gesa Schad, Brigitte Bollig und KyokoWatanabe
18.1 Typische (U)HPLC-Betriebsparameter und ihre Auswirkung auf die chromatographische Leistung 345
18.2 ,,Analytical Intelligence AI, M2M, IoT wie moderne Technologie die Praxis in der Routine erleichtern kann 352
19 Herausforderungen in modernen HPLC-Laboratorien357
Frank Steiner und Soo Hyun Park
19.1 Vanquish Core, Flex und Horizon drei Performance-Level fur spezifische Herausforderungen unserer Zeit 358
19.2 Intelligente und eigenstandige HPLC-Gerate 365
19.3 2D-LC zur Analyse komplexer Proben und fur weitere Automatisierungsmoglichkeiten (siehe auch Kap. 1) 366
19.4 Software-assistierte automatisierteMethodenentwicklung 373
20 Systematische Methodenentwicklung mit einem analytischen Qualityby- Design-Ansatz unter Verwendung von Fusions-QbD und UPLC381
Falk-Thilo Ferse, Detlev Kurth, Tran N. Pham, Fadi L. Alkhateeb und Paul Rainville
Literatur 392
Stichwortverzeichnis 393
