Erstmalig werden in einem Buch alle Aspekte der HPLC-Gradientenelution in den unterschiedlichen Trennmodi umfassend behandelt. Der Anwender findet konkrete Hinweise zur Optimierung von klassischen Lösungsmittelgradienten für RP- und LC-MS-Trennungen neben wertvollen Hinweisen zum Einsatz von Salz-, pH-Wert- und Temperaturgradienten - praxisnah und mit zahlreichen Beispielen.
Teil 1
Aspekte der Gradienten-Optimierung in der RP-Chromatographie
Apparative Einflüsse auf die Qualität von Gradienten-Methoden und deren Übertragung zwischen unterschiedlichen Geräten
Optimierung einer Reversed Phase Gradiententrennung mit EXCEL
Teil 2
Die Gradientelution ionischer Verbindungen
Der Gradient in der Biochromatographie
Spezifika der Gradientenelution in der HILIC
Spezifika der Gradientenelution in der SFC
Der Gradient in LC-MS-Messungen
Stavros Kromidas wurde nach langjahriger Tatigkeit im Verkauf von Waters Chromatography Inhaber und Geschaftsfuhrer der Novia GmbH, spater selbstandiger Berater. Der promovierte Chemiker arbeitet seit 1978 auf dem Gebiet der HPLC und hat seit 1984 zahlreiche Trainingskurse und Workshops geleitet. Er ist Autor einer regelma?igen HPLC-Kolumne in der Zeitschrift 'Labo' sowie einer Reihe au?erordentlich erfolgreicher Bucher.
Vorwort ix
Zum Aufbau des Buches xi
Zu den Autoren xiii
Beitragsautoren xvii
Teil 1 Die Grundsätze der Gradientenelution1
1 Aspekte der Gradienten-Optimierung3
Stavros Kromidas
1.1 Einführung 3
1.2 Besonderheiten des Gradienten 3
1.3 Einige chromatographische Größen und Formeln 5
1.4 Nachweisgrenze, Peakkapazität, Auflösung Möglichkeiten der Optimierung 8
1.4.1 Nachweisgrenze 8
1.4.2 Peakkapazität und Auflösung 10
1.5 Gradienten-Mythen 14
1.6 Beispiele zur Optimierung von Gradientenläufen: ausreichende Auflösung in einer adäquaten Zeit 16
1.7 Gradienten-Aphorismen 38
2 Apparative Einflüsse auf die Qualität von Gradienten-Methoden und deren Übertragung zwischen unterschiedlichen Geräten 43
Frank Steiner
2.1 Arten der technischen Umsetzung der Gradientenelution und die jeweiligen Charakteristika 43
2.1.1 Die niederdruckseitige und die hochdruckseitige Gradientenerzeugung Zwei technisch grundlegend verschiedene Prinzipien 43
2.1.2 Die Rolle der Mischvorrichtung bei HPG- und LPG-Systemen vor dem Hintergrund der verschiedenen Prinzipien der Gradientenformung 45
2.1.3 Die Arbeitsweise von Mischvorrichtungen und die systematische Charakterisierung von deren Effektivität 49
2.1.4 Auswirkungen der Volumenkontraktion beim Mischen von Wasser und organischen Lösemitteln bei Gradientensystemen 62
2.1.5 Auswirkungen kleinster Leckraten von Pumpenköpfen bei sensiblen Applikationen und HPG-Synchronisierungs-Techniken zu deren Korrektur 68
2.2 Die Bestimmung und Bedeutung des Gradientenverzögerungsvolumens der Apparatur 70
2.2.1 Die Bestimmung des GDV und seine Abhängigkeit von den Betriebsbedingungen des Systems 71
2.2.2 Der Einfluss des GDV auf die chromatographischen Ergebnisse 82
2.2.3 Möglichkeiten der GDV-Beeinflussung und seiner Auswirkung durch den Anwender 83
2.3 Die Übertragung von Gradientenmethoden zwischen unterschiedlichen HPLC-Systemen 86
2.3.1 Praktische Tipps zum Umgang mit abweichenden GDVs und Gegenmaßnahmen 86
2.3.2 Was ist bezüglich Druckäbhangigkeit des GDV zu beachten? 89
2.3.3 Auswirkung einer zu großen Elutionsstärke des Probelösemittels im schwachen Laufmittel des Gradientenstarts 91
2.4 Einfluss von Schwankungen der Eluentenzusammensetzung auf die Qualität der Detektion 94
2.4.1 Einfluss eines Referenzkanals auf die Basislinie bei den Diodenarray-Detektoren 95
2.4.2 Die spezielle Herausforderung bei Methoden mit UV-absorbierenden retardierten Additiven wie TFA (Trifluoressigsäure) in der mobile Phase 96
2.5 Weitere Arten der praktischen Anwendung von Gradientensystemen in der HPLC 103
2.5.1 Alternative und kombinierte Gradienten-Modi in der HPLC 103
2.5.2 Vorteile bei der Umsetzung isokratischer Methoden mit Gradientenapparaturen 104
2.5.3 Nutzung von Gradientensystemen bei der Methodenentwicklung und Methodenoptimierung 106
3 Optimierung einer Reversed-Phase-Gradiententrennung mit EXCEL111
Hans-Joachim Kuss
Teil 2 Die Spezifika des Gradienten in einzelnen Trennmodi119
4 Die Gradientelution ionischer Verbindungen121
Joachim Weiss
4.1 Einführung 121
4.2 Theoretische Aspekte 122
4.3 Gradientenarten in der Ionenchromatographie 124
4.4 Wahl des Eluenten 128
4.4.1 Möglichkeiten zur Optimierung von Konzentrationsgradienten 134
4.5 Gradientelution von Anionen an Anionenaustauschern 135
4.6 Gradientelution von Kationen an Kationenaustauschern 146
4.6.1 pH-Gradienten für die Trennung monoklonaler Antikörper 154
4.7 Gradientelution von Anionen und Kationen an Mixed-mode-Phasen 160
5 Der Gradient in der Biochromatographie173
Oliver Genz
5.1 Biomoleküle 173
5.2 Biochromatographie 173
5.3 Der Gradient in der Biochromatographie 174
5.3.1 Ein Gradient, den man unbedingt vermeiden sollte 175
5.4 Gradienten bei unterschiedlichen Biochromatographietechniken 176
5.4.1 Gelfiltration, Size-Exclusion-Chromatography (SEC) 176
5.4.2 Ionenaustauschchromatographie 177
5.4.3 Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) 181
5.4.4 Umkehrphasenchromatographie von Biomolekülen 183
5.4.5 Affinitätschromatographie (AC) 184
5.5 Zusammenfassung 186
6 Spezifika der Gradientenelution in der HILIC187
Thomas Letzel
7 Spezifika der Gradientenelution in der SFC197
Stefan Bieber und Thomas Letzel
7.1 Arten von Gradienten in der SFC 197
7.1.1 Lösungsmittelgradienten 197
7.1.2 Druckgradienten 199
7.1.3 Temperaturgradienten 199
7.2 Effekte von Gradienten 200
8 Der Gradient in LC-MS-Messungen203
Markus M. Martin
8.1 Bedeutung der Gradientelution für LC-MS 203
8.2 Technische Aspekte des Einsatzes von Gradientelution zur LC-MS-Analytik 207
8.2.1 Technische Einflüsse der LC-Anlage: Systemdispersion, Proportionierungspräzision und ihre Bedeutung für MS-Messungen 207
8.2.2 Technische Einflüsse des Massenspektrometers: der LC-Gradient und die Signalerzeugung im MS 212
8.2.3 Quantifizierung im Massenspektrometer innerhalb einer Gradientelution: Matrixeinflüsse und ihre Kompensation 219
8.2.4 MS-Auslastung in der Gradientelution Säulenäquilibrierung als Durchsatzvernichter 222
8.2.5 Gradientenverzögerung, Flussrate und Säulendimension wieviel hilft Downsizing bei Gradiententrennungen in der LC-MS? 224
8.3 Fazit 227
8.4 Abkürzungen 227
9 Zusätzliche Werkzeuge zur Methodenverbesserung: Fluss- und Temperaturgradienten 231
Egidijus Machtejevas
9.1 Einleitung 231
9.2 Temperaturgradienten 231
9.3 Flussgradienten 232
9.3.1 Kombination von Fluss- und Temperaturgradienten 233
9.3.2 Fallbeispiele 233
9.4 Schlussfolgerung 236
Stichwortverzeichnis 239
